如何有效降低螢光 IHC 中的自發螢光？

有效降低螢光 IHC 中的自發螢光是確保清晰影像的關鍵步驟，因為自發螢光會掩蓋目標信號，導致判讀困難。 自發螢光主要源於組織中的內源性物質，如紅血球、膠原蛋白、彈性纖維、脂褐素（lipofuscin）和醛基（aldehydes），這些物質在特定波長下會發出螢光，尤其在福馬林固定石蠟包埋 (FFPE) 組織中更為常見。

自發螢光來源複雜，其中紅血球的血紅蛋白在綠色和紅色通道有較強的自發螢光，而脂褐素則在多個通道廣泛發光。根據研究，高達 80% 的 FFPE 組織切片可能表現出不同程度的自發螢光干擾，顯著影響螢光信號的信噪比。

自發螢光的常見成因與影響

組織中的醛基是福馬林固定後殘留的產物，它們會與螢光染料產生非特異性結合，進而產生自發螢光。此外，組織本身的代謝產物，如核黃素（riboflavin）和 NADH，以及某些治療藥物，也可能具有螢光特性。

過度固定或固定不當是導致自發螢光增加的常見原因之一。例如，福馬林固定時間過長會增加醛基的累積，使組織背景螢光更強。這不僅降低了目標信號的對比度，也可能導致假陽性結果的誤判。

降低自發螢光的有效策略

為了解決自發螢光問題，實驗室可採用多種策略。首先是優化組織固定條件，避免長時間固定，並確保使用新鮮配製的固定液。其次，使用自發螢光淬滅劑是直接有效的處理方式。

常用的淬滅劑包括：

• 蘇丹黑 B (Sudan Black B)：可有效淬滅脂褐素的自發螢光，尤其適用於腦組織和腎臟組織。建議使用 0.1-0.3% 蘇丹黑 B 溶液，處理 10-20 分鐘。
• 氯化銨 (Ammonium Chloride)：針對醛基引起的自發螢光有較好的效果，通常使用 50 mM 濃度處理 30 分鐘。
• 過氧化氫 (Hydrogen Peroxide)：可淬滅內源性過氧化物酶活性，間接減少部分自發螢光，但主要用於 DAB 顯色。
• 專用自發螢光淬滅套組：市售的商業套組通常包含多種成分，能更全面地解決不同來源的自發螢光問題，例如某些產品聲稱可降低高達 70% 的背景螢光。

選擇合適的螢光染料也能有效避免自發螢光。建議選用發射波長在遠紅外光區（如 Cy5、Cy7）的螢光染料，因為組織的自發螢光在短波長（藍、綠光）區域較強，而在長波長區域則顯著減弱。

如何有效預防螢光 IHC 中的光漂白現象？

有效預防螢光 IHC 中的光漂白現象是維持螢光信號穩定性和影像品質的關鍵，尤其在長時間觀察或高強度激發光下。 光漂白（Photobleaching）是指螢光分子在受到激發光照射後，其螢光強度會逐漸衰減甚至完全消失的現象，這是由於螢光染料發生不可逆的化學變化所致。

光漂白是螢光成像中不可避免的挑戰，它會導致信號損失，使得定量分析變得困難，並限制了多重螢光染色的應用。據估計，在常規螢光顯微鏡下，某些螢光染料在數秒內就可能損失 50% 的初始螢光強度。

光漂白的成因與影響

光漂白主要由高強度激發光、長時間曝光、活性氧自由基以及螢光染料本身的化學性質所引起。當螢光分子從激發態回到基態時，有時會與周圍的氧分子或其他化學物質反應，形成非螢光產物。

其影響包括：

• 信號衰減：導致目標蛋白的螢光強度降低，甚至完全消失，使得弱表達的蛋白難以被檢測。
• 定量分析失準：由於螢光強度隨時間變化，使得不同樣本或同一樣本不同區域的定量比較變得不可靠。
• 多重染色困難：在進行多重螢光染色時，一個通道的光漂白可能會影響其他通道的信號。

預防光漂白的實用策略

預防光漂白需要從多方面著手，包括實驗操作、試劑選擇和儀器設置：