⚠️ 重要提醒

DAB 試劑應新鮮配製，並避免光照，因為其對光敏感，易氧化失效，影響顯色效果。根據美國病理學會（CAP）的質量指南，新鮮配製的 DAB 溶液可確保最佳反應活性。

內源性過氧化酶的阻斷優化

組織中若存在內源性過氧化酶（Endogenous Peroxidase）活性，會與 DAB 試劑反應產生非特異性染色，導致背景過深。雖然常規實驗會使用過氧化氫（H2O2）阻斷，但若阻斷不完全，仍可能造成問題。建議檢查 內源性過氧化酶活性的阻斷方法 是否足夠。

• 延長阻斷時間：將 H2O2 阻斷時間從 10 分鐘延長至 15-20 分鐘。
• 提高 H2O2 濃度：在不損傷組織的前提下，可適度提高 H2O2 濃度（通常為 3%）。
• 新鮮配製 H2O2：確保使用的 H2O2 溶液是新鮮配製且活性良好。

如何解決 DAB 顯色過淺的問題？

DAB 顯色過淺通常表示信號強度不足，可能源於抗原表位暴露不充分、抗體效價低、顯色時間不足或 DAB 試劑活性下降，導致陽性信號微弱甚至缺失。解決此問題的策略是增強信號，同時保持背景清晰。

「IHC 染色信號太弱是實驗室最常見的挑戰之一，約 60% 的弱陽性結果可透過抗原修復和抗體優化得到顯著改善。」

— Journal of Clinical Pathology, 2018

延長顯色時間

最直接的解決方案是延長 DAB 作用時間。如果初始顯色時間過短，陽性信號可能尚未充分發展。可以嘗試將顯色時間從 5 分鐘延長至 10 分鐘，甚至 15-20 分鐘，但仍需在顯微鏡下觀察，避免過度顯色導致背景染色。根據 WHO 2022 年腫瘤分類指南，許多生物標誌物的判讀，其染色強度與顯色時間有直接相關性。

若顯色時間已達上限（如 20 分鐘），仍無明顯改善，則需考慮其他因素，例如 IHC 染色信號太弱的排除策略。

增加 DAB 試劑濃度

提高 DAB 工作液的濃度可以增強顯色反應的強度。如果使用的是稀釋後的 DAB 試劑，可以嘗試使用更高濃度的溶液，例如從 0.5X 調整為 1X，或從 1X 調整為 2X（若產品允許）。然而，過高的濃度可能增加背景染色風險，需謹慎評估。

抗原修復的優化

抗原修復（Antigen Retrieval, AR）是 IHC 實驗中恢復因福馬林固定而遮蔽的抗原表位，使其能與抗體結合的關鍵步驟。若顯色過淺，很可能是抗原修復不充分。這也是根據 CAP 統計，約 75% 的 IHC 染色失敗可追溯至組織固定不當或抗原修復不足。

• 調整修復方式：嘗試從酶消化法改為熱誘導抗原修復（Heat-Induced Epitope Retrieval, HIER），或反之。HIER 通常效果更佳。
• 優化修復液 pH 值：HIER 常用的修復液有檸檬酸緩衝液（pH 6.0）和 EDTA 緩衝液（pH 9.0）。針對不同抗原，選擇最適合的 pH 值至關重要。
• 延長修復時間或提高溫度：在不損傷組織的前提下，適度延長高溫修復時間或提高溫度。

一抗與二抗的優化

一抗（Primary Antibody）和二抗（Secondary Antibody）的品質與濃度對顯色強度有決定性影響。若顯色過淺，應檢查抗體相關因素：

• 提高抗體濃度：嘗試使用更高濃度的一抗或二抗。通常建議進行滴定實驗，找出最佳稀釋比例。
• 延長孵育時間：適度延長一抗或二抗的孵育時間，例如從 30 分鐘延長至 60 分鐘，甚至過夜（4°C）。
• 檢查抗體效價：確認抗體是否過期或活性下降。批次間的差異也可能影響結果。